Первые упоминания о планах по созданию иконостаса Петропавловского собора относятся к марту 1722, когда архитектор Доменико Трезини направил секретарю Петра I Макарову схематичный чертеж, или «меру», предполагаемой алтарной преграды. Через две недели Петр лично «словесно повелел» московскому зодчему Ивану Зарудному приступить к созданию иконостаса. Зарудный был хорошо знаком императору по различным архитектурным и монументально-декоративным сооружениям: он строил дворцовые комплексы и храмы, возводил триумфальные арки, создавал объекты малой архитектуры, к числу которых относятся иконостасы.
Работы начали в октябре того же года на московском дворе Зарудного, где к этому времени был подготовлен необходимый строительный материал. Конструктивную основу иконостаса выполнили из лиственницы и дуба, резные элементы из более мягкой древесины. Под руководством архитектора трудились 17 столяров, 19 резчиков и 8 позолотчиков, о чем свидетельствует «реестр мастеровым людям». Основные столярные и резные работы завершили к концу 1725 года.
Параллельно с золочением иконостаса начались работы по написанию икон, их создание проходило под руководством директора Санкт-Петербургской типографии Михаила Аврамова. Договор по написанию образов был заключен с иконописцем Андреем Меркурьевым (Поспеловым) «со товарищи». Иконы писались по всем правилам и канонам, на кипарисовых досках темперными красками. Аврамов предоставлял утвержденные Синодом «куншты», то есть образцы, по которым мастера должны были работать, при этом зачастую основой для написания православных икон служили западноевропейские гравюры XVII века. Московские иконописцы завершили выполнение государственного заказа к ноябрю 1729 года, моменту приемки икон художественной комиссией.
Спустя столетие местный ряд алтарной преграды дополнили четыре иконы, созданные русским живописцем, академиком Дмитрием Антонелли.